植物免疫沉淀試劑盒應用介紹

更新時間：2025-06-18

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　　植物免疫沉淀試劑盒是用于研究植物體內蛋白質相互作用或蛋白質-DNA相互作用的重要工具，應用介紹：

　　研究蛋白質相互作用：如確定兩種蛋白質在完整細胞內生理性相互作用，可用于磷酸化位點分析、激酶活性分析、乙酰化位點發現與鑒定等研究分析。

　　研究蛋白質-DNA相互作用：用于葡萄轉錄因子VlbZIP30抗旱功能及其調控機理研究等。從葡萄品種中克隆到VlbZIP30，并通過遺傳轉化模式植物，研究VlbZIP30對干旱脅迫響應的功能及其調控機制。EMSA、雙熒光素酶活性分析和染色質免疫沉淀(ChIP)-qPCR實驗結果表明，VlbZIP30可以直接特異性結合木質素生物合成基因和干旱響應基因啟動子上的G-box順式作用元件，以激活其表達，最終賦予轉基因葡萄的抗旱性。

　　操作流程(以植物染色質免疫沉淀分析試劑盒為例)

　　準備溶液：如90%乙醇、70%乙醇、37%甲醛、2M甘氨酸溶液、14.3M β-巰基乙醇、1X TE緩沖液(pH 8.0)等(不提供，可單買)，并確保所有的緩沖液是清澈的。

　　抗體結合在微孔板中

　　預估實驗所需聯管的數量，小心確保從板架上移走不需要的聯管并把他們放回袋子(輕輕合上袋子并儲存在4°C)。使用150 μl 的CP1清洗孔一次。

　　每孔添加100 μl的CP2，并依次加入如下抗體：加1 μl的Normal-Mouse IgG作為陰性對照和加1 μl的Anti-Dimethyl H3-K9作為陽性對照，并添加2 - 3 μg自己感興趣的抗體到樣本孔。

　　使用保鮮膜(封板膜或石蠟封口膜)緊緊密封條板，避免蒸發并在室溫孵育60 - 90分鐘。孵育完后，移走孵育過的抗體溶液并吸取150 μl的CP2用移液器來回清洗孔三遍。同時，從細胞中制備DNA片段。

　　收集組織和在活的有機體內交聯(以單層或附著細胞為例)

　　從生長在土壤中或在50 ml的試管內，收集0.8 - 1g的植物組織(花，葉片和幼種)。

　　使用20ml的去離子水輕柔地沖洗組織兩遍。

　　在圓錐管(被甲醛浸泡的組織)的頂端填滿50 ml并使用尼龍紗布保證組織的滲入在真空滲入(并有利于清洗步驟)的過程中。另外，需要使用類似縫衣針的工具在圓錐管蓋上扎些孔，然后將蓋子蓋上。

　　在真空泵的附件上，干燥器上真空滲入組織10分鐘。甲醛溶液應該煮沸。

　　組織裂解和基因組DNA剪切

　　添加1.25ml 2M的甘氨酸溶液(終濃度是0.125 M)熄滅交聯并繼續使用真空滲入持續5分鐘。

　　移走甲醛并使用20 ml的去離子水沖洗組織兩遍。在漂洗后，盡最大可能移走水。在這個實驗階段，交聯好的組織要么在液氮中冷凍保存或–80°C儲存，要么直接用來進行核染色質的提取。

　　以1:5的比例(1X CP3C)，使用蒸餾水稀釋CP3C。添加3.5ul的BME到每10ml的1X CP3C。使用液氮研磨組織成精細粉末。將粉末放入裝有20 ml 1X CP3C的50ml的圓錐管中，然后渦旋并放在冰上。

　　過濾液通過二層的米拉布流入到50ml的管子中并以轉速4000 rpm(1900X g)離心過濾液20分鐘。

　　添加1ul BME到每1ml的CP3D中。移走上清液并在包含BME的1ml CP3D再次懸浮小球。轉移再次懸浮的小球到一個1.5 ml的管子中并在4°C轉速12,000 rpm持續離心10分鐘直至有核產物出現(在這個階段可以看到有白色的小球)。

　　添加1ul BME到每1ml的CP3E中。移走上清液并在包含BME的300 ul CP3E再次懸浮小球。

　　添加包含BME的300 ul CP3E到一個新的1.5 ml的管子中。從第6步中300 ul的緩沖液頂端將小球重懸并在4°C轉速14,000 rpm持續離心45分鐘。

　　移走上清液并在包含Protease Inhibitor Cocktail(PIC)(如：每1ml的CP3F添加10ul的PIC)的500 ul CP3F再次重懸染色質。通過聲處理設備剪切DNA。例如：在冰上對染色質溶液進行超聲理五次，每次在工作周期的40%的時候，15秒；將布蘭森超聲設備的功率設置在2。在每次超聲波處理中，需將樣本放置在冰上1分鐘。若有必要，取5ul聲處理過的細胞裂解物進行瓊脂糖凝膠電泳分析。剪切的DNA大小應該是在200 - 1000 bp。

　　在4°C，轉速14,000 rpm，離心細胞碎片小球10分鐘。

　　蛋白/DNA免疫沉淀

　　轉移清澈的上清液到一個新的1.5ml的離心管。(在這一步，上清液需儲存在–80°C)按照所需以1:1的比例使用CP4稀釋上清液(如：添加100 μl的CP4到100 μl的上清液)。

　　轉移5 μl稀釋的上清液到0.5ml瓶中。

　　轉移100 μl稀釋的上清到每個包被抗體的孔中。使用保鮮膜(封口膜或石蠟封口膜)緊緊密封條板，避免蒸發并在搖床(50 - 100 rpm)上室溫(22 - 25°C)孵育60 - 90分鐘。

　　轉移上清液。使用150 μl的CP1清洗孔六次。允許在搖床(100 rpm)上進行2分鐘的清洗。每次使用150 μl的1X TE緩沖液清洗孔(2分鐘)。

　　交聯DNA反轉/純化

　　添加1μl的蛋白酶K到每40 μl的CP5中并混合。添加40μl包含蛋白酶K的CP5到樣本孔(包含“輸入DNA”瓶)。使用保鮮膜(膠套膜或石蠟封口膜)緊緊密封條板，避免蒸發并在水浴下65°C水育15分鐘。

　　添加40 μl的CP6到樣本孔中，混合，使用保鮮膜(膠套膜或石蠟封口膜)緊緊密封條板，避免蒸發并在水浴下65°C孵育90分鐘。同樣，添加40μl包含上清液，標有“輸入DNA”的CP6到瓶中。

　　將離心柱放置在2ml的離心管中。添加150 μl的CP7到樣本中并將混合液轉移到柱子中。

　　添加200 μl的70%的乙醇到柱子中，以12000rpm離心15秒。

　　將柱子放置在一個新的收集管中。添加200 μl的90%的乙醇到柱子中，以12000rpm離心20秒。

　　從收集管轉移柱子并棄廢液。將柱子放置在一個新的收集管中。再次添加200 μl的90%的乙醇到柱子中，以12000rpm離心35秒。

　　放置柱子到新的1.5 ml瓶中。直接添加10 - 20 μl的CP8到柱基質中并以12000rpm全速離心20秒來洗脫純化的DNA。現在DNA可以使用了，或在 - 20°C儲存。

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