Western及IP細胞裂解液(弱）

產(chǎn)品貨號：W0013

儲存條件：-20℃

產(chǎn)品描述

Western及IP細胞裂解液(Cell lysis buffer for Western and IP)，是一種在非變性條件下裂解細胞或組織樣品從而制備蛋白樣品的裂解液。本裂解液裂解的細胞或組織樣品，可以用于PAGE，Western，免疫沉淀(immunol precipitation，IP)、免疫共沉淀(co-IP)和ELISA等。

本產(chǎn)品可以用于動物、植物的細胞或組織樣品，也可以用于真菌或細菌樣品。

使用說明：

1.對于培養(yǎng)細胞樣品：

a.融解Western及IP細胞裂解液，混勻。取適當(dāng)量的裂解液，在使用前數(shù)分鐘內(nèi)加入PMSF，使PMSF的最終濃度為1mM，或者根據(jù)實驗需要加入適當(dāng)?shù)纳鲜龅鞍酌噶姿崦敢种苿┗旌衔铩?/span>

b.對于貼壁細胞：去除培養(yǎng)液，用PBS、生理鹽水或無血清培養(yǎng)液洗一遍(如果血清中的蛋白沒有干擾，可以不洗)。按照6孔板每孔加入100-200微升裂解液的比例加入裂解液。用槍吹打數(shù)下，使裂解液和細胞充分接觸。通常裂解液接觸動物細胞1-2秒后，細胞就會被裂解。植物細胞宜在冰上裂解2-10min。

對于懸浮細胞：離心收集細胞，輕輕vortex或者彈擊管底以把細胞盡量分散開。按照6孔板每孔細胞加入100-200微升裂解液的比例加入裂解液。輕彈管底以充分裂解細胞。充分裂解后應(yīng)沒有明顯的細胞沉淀。如果細胞量較多，必需分裝成50-100萬細胞/管，然后再裂解。大團的細胞較難裂解充分，而少量的細胞由于裂解液容易和細胞充分接觸，相對比較容易裂解充分。

對于細菌或酵母：對于1ml菌液或酵母液，離心去上清，如果有必要可以使用PBS洗滌一次，充分去除液體后，輕輕vortex或者彈擊管底以把細菌或酵母盡量彈散。加入100-200微升裂解液，輕輕vortex或者彈擊管底以混勻，冰上裂解2-10min。如果希望獲得更好的裂解效果，細菌和酵母可以分別使用溶菌mei和破壁酶(Lyticase)消化，然后再使用本裂解液進行裂解。

裂解液用量說明：

通常6孔板每孔細胞或者1ml的菌液或酵母液中的細菌和酵母量加入100微升裂解液已經(jīng)足夠，但如果細胞密度非常高可以適當(dāng)加大裂解液的用量到150微升或200微升。每100萬動物細胞用100微升本產(chǎn)品裂解后獲得的上清，其蛋白濃度約為2-4mg/ml，不同細胞有所不同。

c.充分裂解后，10000-14000g離心3-5分鐘，取上清，即可進行后續(xù)的PAGE、Western、免疫沉淀和免疫共沉淀等操作。

2.對于組織樣品：

a.把組zhi剪切成細小的碎片。

b.融解Western及IP細胞裂解液，混勻。取適當(dāng)量的裂解液，在使用前數(shù)分鐘內(nèi)加入PMSF，使PMSF的最終濃度為1mM，或者根據(jù)實驗需要加入適當(dāng)?shù)纳鲜龅鞍酌噶姿崦敢种苿┗旌衔铩?/span>

c.按照每20毫克組織加入100-200微升裂解液的比例加入裂解液。(如果裂解不充分可以適當(dāng)添加更多的裂解液，如果需要高濃度的蛋白樣品，可以適當(dāng)減少裂解液的用量。)

d.用玻璃勻漿器勻漿，或使用碧云天生產(chǎn)的E6600 TissueMaster™手持式組織研磨儀研磨，直至充分裂解。也可以把組織樣品冷凍后液氮研磨，研磨充分后加入裂解液進行裂解。

e.充分裂解后，10000-14000g離心3-5分鐘，取上清，即可進行后續(xù)的PAGE、Western、免疫沉淀和免疫共沉淀等操作。每20mg凍存的小鼠肝臟組織用200微升本裂解液裂解后獲得的上清，其蛋白濃度約為15-25mg/ml，不同狀態(tài)的不同組織有所不同。

f.如果組織樣品本身非常細小，可以適當(dāng)剪切后直接加入裂解液裂解，通過強烈vortex使樣品裂解充分。然后同樣離心取上清，用于后續(xù)實驗。直接裂解的優(yōu)點是比較方便，不必使用勻漿器或研磨設(shè)備，缺點是不如勻漿或研磨那樣裂解比較充分。

注：

對于某些特殊蛋白的IP，如果發(fā)現(xiàn)Western及IP細胞裂解液(P0013)效果不是非常理想，可以嘗試用RIPA裂解液(強、中或弱)或NP-40裂解液。如果發(fā)現(xiàn)IP的時候背景很高，即非特異的蛋白也被IP下來，則需要選用裂解強度較高的裂解液，例如RIPA裂解液(強或中)。如果發(fā)現(xiàn)目的蛋白無法被IP下來，則說明裂解液的強度過強，可以使用較為溫和的裂解液例如RIPA裂解液(弱)或NP-40裂解液。